【收藏】ATAC-seq技術(shù)原理及在植物器官發(fā)育中的應(yīng)用

什么是ATAC-seq？

染色質(zhì)開放性測序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，ATAC-seq），一種用于檢測染色質(zhì)開放性的高通量測序技術(shù)，通過Tn5轉(zhuǎn)座酶切割并標(biāo)記開放的染色質(zhì)區(qū)域，從而揭示基因組中調(diào)控元件（如增強(qiáng)子、啟動子）的位置和活性。

技術(shù)原理

在真核生物中，DNA并不是裸露存在的，而是與組蛋白等結(jié)合形成染色質(zhì)。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)會影響基因的表達(dá)，那些處于開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域，更容易與轉(zhuǎn)錄因子等蛋白結(jié)合，進(jìn)而啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程。ATAC-seq利用Tn5轉(zhuǎn)座酶識別并切割染色質(zhì)中開放區(qū)域的DNA，切割后的DNA片段直接用于文庫構(gòu)建和測序。測序結(jié)果通過生物信息學(xué)分析，可以確定基因組中開放染色質(zhì)區(qū)域的位置和特征。

植物的生長發(fā)育是一個高度復(fù)雜且精密調(diào)控的過程，從種子萌發(fā)到器官形成，從開花結(jié)果到衰老凋亡，每一個階段都涉及海量基因的時空特異性表達(dá)。而這些基因的表達(dá)模式，很大程度上受到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的調(diào)控——開放的染色質(zhì)區(qū)域為轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控蛋白提供了結(jié)合位點，進(jìn)而啟動或抑制基因轉(zhuǎn)錄，最終影響器官的形態(tài)建成與功能實現(xiàn)。

ATAC-seq憑借其對染色質(zhì)開放區(qū)域的精準(zhǔn)捕捉能力，打破了傳統(tǒng)研究中僅依賴基因表達(dá)數(shù)據(jù)推測調(diào)控機(jī)制的局限。它像一把“分子鑰匙"，能夠直接解鎖基因組中那些隱藏的調(diào)控密碼：通過定位不同發(fā)育階段、不同組織器官中的開放染色質(zhì)區(qū)域（ACRs），研究者可以直觀地觀察到調(diào)控元件（如啟動子、增強(qiáng)子）的活性變化，進(jìn)而關(guān)聯(lián)其與下游靶基因的表達(dá)聯(lián)動關(guān)系。這種從“結(jié)構(gòu)動態(tài)"到“功能效應(yīng)"的研究思路，為揭示植物器官發(fā)育的深層調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

在植物研究領(lǐng)域，ATAC-seq技術(shù)為解析器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供了全新視角。以下通過具體案例，進(jìn)一步展示ATAC-seq在解析植物器官發(fā)育分子機(jī)制中的實際應(yīng)用。

ATAC-seq在植物器官發(fā)育研究中的應(yīng)用案例

案例1：ATAC-seq在蘋果果實發(fā)育中糖酸積累調(diào)控機(jī)制研究中的應(yīng)用

文章標(biāo)題：Transcriptional landscape and dynamics involved in sugar and acid accumulation during apple fruit development

研究背景：

蘋果是溫帶重要果樹，果實品質(zhì)（如風(fēng)味）主要由可溶性糖和有機(jī)酸決定。盡管已知果實發(fā)育中糖酸動態(tài)變化（早期有機(jī)酸積累、后期淀粉降解為糖），但轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其積累的分子機(jī)制仍不明確。染色質(zhì)可及性影響基因轉(zhuǎn)錄，而蘋果果實發(fā)育中染色質(zhì)可及性景觀尚未闡明。

研究思路：

關(guān)鍵結(jié)果：

該研究通過ATAC-seq分析蘋果成熟葉片及果實3個關(guān)鍵發(fā)育階段，揭示染色質(zhì)可及性的組織與發(fā)育特異性：葉片染色質(zhì)開放區(qū)域（ACRs）約為果實的1.5倍，果實ACRs隨成熟逐漸增加，且主要分布于啟動子-轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域。比較不同階段發(fā)現(xiàn)，差異可及區(qū)域（DARs）變化幅度大于差異表達(dá)基因，整合后篩選出啟動子可及性和表達(dá)量均增加的基因（PEIGs），富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、碳水化合物代謝等通路。對DARs區(qū)域進(jìn)行motif分析，發(fā)現(xiàn)362個果實富集motif，含29個果實特異性motif，涉及Dof、AP2/ERF等家族轉(zhuǎn)錄因子，其中5個Dof家族基因經(jīng)驗證可結(jié)合糖酸代謝相關(guān)基因啟動子并調(diào)控其表達(dá)。同時證實糖酸代謝關(guān)鍵基因啟動子區(qū)域可及性隨成熟增加，與基因表達(dá)上調(diào)一致，受染色質(zhì)開放狀態(tài)及Dof家族轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控。

圖1. 蘋果葉片和果實發(fā)育階段12個文庫的ATAC-seq分析。

圖2. 蘋果果實3個發(fā)育階段ATAC-seq與RNA-seq的關(guān)聯(lián)分析。

圖3. 蘋果果實中糖和酸代謝相關(guān)基序的分析。

圖4. 驗證所選果實特異性轉(zhuǎn)錄因子與其候選靶基因在糖或酸積累中的相互作用。

案例2：ATAC-seq在葫蘆科作物早期果實發(fā)育相關(guān)保守順式調(diào)控元件研究中的應(yīng)用

文章標(biāo)題：Identification and functional characterization of conserved cis-regulatory elements responsible for early fruit development in cucurbit crops

研究背景：

順式調(diào)控元件（CREs）通過調(diào)控基因表達(dá)影響表型，是作物改良的重要靶點。葫蘆科作物（如黃瓜、西瓜等）從下位子房發(fā)育成果實，早期果實發(fā)育存在相似生物學(xué)過程（如細(xì)胞分裂向擴(kuò)張的轉(zhuǎn)變），但相關(guān)保守CREs尚未明確。

研究思路：

關(guān)鍵結(jié)果：

該研究聚焦葫蘆科作物早期果實，探究了葫蘆科作物早期果實發(fā)育相關(guān)的順式調(diào)控元件（CREs）。通過比較基因組學(xué)在6種葫蘆科作物及5種外類群物種中鑒定出392,438個保守非編碼序列（CNSs），其中 82,756 個為葫蘆科作物中呈現(xiàn)的特異性序列。同時，通過ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，在6種葫蘆科作物果實的2個組織、2個關(guān)鍵發(fā)育階段（細(xì)胞分裂期和擴(kuò)張期）定位了20,865至43,204個可及染色質(zhì)區(qū)域（ACRs），這些區(qū)域與基因表達(dá)水平正相關(guān)，且存在組織和階段特異性。通過整合分析，研究發(fā)現(xiàn)4,431個共線同源CNSs在6種作物中均與ACRs重疊，其中 1,687 個為葫蘆科作物中呈現(xiàn)的特異性序列，推測這些序列通過調(diào)控757個相鄰?fù)椿騾⑴c早期果實發(fā)育，并受強(qiáng)進(jìn)化約束。CRISPR突變實驗進(jìn)一步驗證，靶向 NAC1 和 EXT-like 基因附近的葫蘆科作物特異性 CNSs 后，基因表達(dá)模式顯著改變，果實形狀和細(xì)胞尺寸也發(fā)生明顯變化，直接證明了這些CNSs的調(diào)控功能。綜上，該研究不僅為葫蘆科作物遺傳改良提供了關(guān)鍵靶點，還揭示了CREs在植物發(fā)育和進(jìn)化中的重要性，為深入理解保守調(diào)控元件的功能及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖1. 六種葫蘆科作物中兩個關(guān)鍵階段的兩種組織ACRs的鑒定與表征。

圖2. 六種葫蘆科作物中ACR的保守性。

圖3. 與六種葫蘆科植物中ACR重疊的1,687個葫蘆科特異性CNS潛在靶基因特征分析。

案例3：ATAC-seq在玉米葉片發(fā)育過程中染色質(zhì)可及性研究中的應(yīng)用

文章標(biāo)題：Dynamic Chromatin Accessibility and Gene Expression Regulation During Maize Leaf Development

研究背景：

玉米是重要的糧食作物和模式生物，葉片作為光合作用主要器官，其發(fā)育直接影響產(chǎn)量；染色質(zhì)可及性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)，但在玉米葉片不同發(fā)育階段的具體作用尚不明確。

研究思路：

關(guān)鍵結(jié)果：

本研究旨在探究玉米葉片BBCH_11、BBCH_13、BBCH_17三個發(fā)育階段中染色質(zhì)可及性的動態(tài)變化及其對全基因組基因表達(dá)的影響，通過ATAC-seq（檢測染色質(zhì)可及性）和RNA-seq（分析基因表達(dá)）的整合分析，發(fā)現(xiàn)三個階段分別鑒定出46,808、38,242、41,084個可及染色質(zhì)區(qū)域（ACRs），且ACR的數(shù)量和強(qiáng)度顯著影響基因表達(dá)水平；同時識別出與葉片發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和潛在轉(zhuǎn)錄抑制因子，揭示了染色質(zhì)可及性通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在玉米葉片時空基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用。

圖1. 實驗裝置和ATAC-seq質(zhì)量評估。

圖2. 與ACRs相關(guān)的基因表達(dá)水平。

圖3. ACR在葉片發(fā)育過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化。

圖4. 階段特異性ACR相關(guān)基因的功能分析。

圖5. 與差異峰強(qiáng)度（DPI）相關(guān)的基因的功能分析。

圖6. 不同葉片發(fā)育階段調(diào)控DNA元件的鑒定。