原核蛋白表達(dá)常見(jiàn)的問(wèn)題有哪些？

　　原核表達(dá)是指通過(guò)基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體并導(dǎo)入表達(dá)菌株的方法，使其在特定原核生物或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

　　一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株。如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測(cè)等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)考慮，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。下面介紹下原核表達(dá)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題。

　　一、為什么目的蛋白總是以包涵體形式出現(xiàn)?

　　在原核表達(dá)純化中目的蛋白經(jīng)常發(fā)生錯(cuò)誤折疊，并聚集成為包涵體。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后目的蛋白表達(dá)通常可達(dá)細(xì)胞總蛋白的50%以上，雖然有一定比例的蛋白以可溶形式存在，多達(dá)95%的蛋白則存在于包涵體。為了獲得更多可溶蛋白，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可以降低誘導(dǎo)溫度，例如16-30℃，或降低IPTG濃度（0.01-0.1mM）并延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間，還可以采用特別的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌。

　　二、跨膜蛋白為什么很難表達(dá)?

　　跨膜蛋白的表達(dá)成功率相對(duì)較低是一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題，主要原因可能有兩個(gè)：

　　1.跨膜蛋白一般都是強(qiáng)疏水性的氨基酸分子和親水性的分子跳躍式鏈接，形成的親水疏水的一個(gè)簡(jiǎn)單的跨膜化學(xué)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)形似。而對(duì)于原核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，簡(jiǎn)單的細(xì)胞器很難像真核細(xì)胞一樣完成信號(hào)肽的識(shí)別及切除、引導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體重新包裝及分泌這一復(fù)雜過(guò)程，有些蛋白多次跨膜，對(duì)于原核細(xì)胞來(lái)說(shuō)幾乎是不可能完成的任務(wù)。

　　2.對(duì)于疏水性片段，在原核細(xì)胞表達(dá)中非常容易形成包涵體，疏水性多肽會(huì)抑制翻譯過(guò)程，甚至與原核膜結(jié)構(gòu)融合形成毒性，處于生物自我保護(hù)的本能，所有細(xì)胞器都會(huì)停止合成蛋白的過(guò)程。