2025年7月6日，浙江大學(xué)徐娟教授團(tuán)隊(duì)在New Phytologist期刊發(fā)表了一篇題為“A DELLA-ANAC106 reciprocal negative feedback circuit modulates gibberellin homeostasis to regulate male fertility in Arabidopsis"研究論文。該研究借助DAP-seq技術(shù)揭示了擬南芥中DELLA-ANAC106雙向負(fù)反饋回路調(diào)控赤霉素（GA）穩(wěn)態(tài)以維持雄性育性的分子機(jī)制，為植物生殖過(guò)程中植物激素調(diào)控提供新范式，也為作物遺傳改良提供了重要的理論基礎(chǔ)和潛在靶點(diǎn)。
文章主要內(nèi)容
研究背景
花粉形成是開(kāi)花植物繁殖的關(guān)鍵，其發(fā)育與花藥絨氈層（最內(nèi)層細(xì)胞）的精準(zhǔn)調(diào)控緊密相關(guān)。絨氈層需通過(guò)程序性細(xì)胞死亡（PCD）為花粉提供營(yíng)養(yǎng)，提前或延遲降解均會(huì)致花粉敗育。赤霉素（GA）的劑量與合成位置對(duì)花粉發(fā)育至關(guān)重要：GA缺陷突變體（如ga1-3）花粉發(fā)育停滯，過(guò)量GA也會(huì)引發(fā)雄性不育，足見(jiàn)GA穩(wěn)態(tài)是育性核心調(diào)控因素。
GA通過(guò)結(jié)合受體GID1降解DELLA抑制蛋白激活信號(hào)，擬南芥中DELLA蛋白（如RGA、GAI）是花藥發(fā)育關(guān)鍵抑制因子，其突變會(huì)致不育。雖GA代謝通路已明晰，但花粉發(fā)育中GA水平調(diào)控的分子機(jī)制仍不明，且NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在該過(guò)程中的作用未知。
研究結(jié)果
研究發(fā)現(xiàn)AT3G12910受MPK3/MPK6激活上調(diào)，經(jīng)鑒定為新NAC轉(zhuǎn)錄因子ANAC106。為研究其功能，作者構(gòu)建了ANAC106過(guò)表達(dá)株系（OE），發(fā)現(xiàn)高表達(dá)株系嚴(yán)重矮化無(wú)花序，中等表達(dá)株系表現(xiàn)為雄性不育，無(wú)法形成可育角果。亞歷山大染色顯示，OE株系花藥無(wú)可育花粉；野生型花粉授粉可使OE株系結(jié)籽，表明其雌性器官功能正常。GUS染色顯示，ANAC106在幼嫩花藥中高表達(dá)，表明其在雄性生殖過(guò)程中的特異性作用。作者進(jìn)一步構(gòu)建了ANAC106-EAR顯性負(fù)性株系，發(fā)現(xiàn)EAR株系與OE株系表型相似，均表現(xiàn)為雄性不育，花藥成熟花粉極少；且自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的該株系也不育。綜上表明，ANAC106過(guò)表達(dá)與抑制的正常功能與均會(huì)導(dǎo)致擬南芥雄性不育。
圖1. 過(guò)量表達(dá)ANAC106導(dǎo)致擬南芥雄性嚴(yán)重不育
圖2. 顯性負(fù)調(diào)控ANAC106同樣會(huì)導(dǎo)致擬南芥雄性不育
為探究OE和EAR株系雄性不育機(jī)制，作者觀察不同發(fā)育階段花藥半薄切片，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，EAR株系花藥第9-10階段絨氈層降解延遲，第9階段絨氈層肥大、小孢子降解，第12階段花粉敗育；OE花藥絨氈層發(fā)育不良且降解提前，第9階段無(wú)完整絨氈層，第10階段降解，第11階段花粉敗育。相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)顯示，DYT1、MYB35（TDF1）等絨氈層發(fā)育基因，在OE和EAR花序中表達(dá)均較低；絨氈層降解相關(guān)的CEP1、PASPA3基因在OE中表達(dá)顯著高于野生型，EAR中CEP1表達(dá)降低。綜上表明，ANAC106是花藥絨氈層細(xì)胞程序性降解的重要正調(diào)控因子。
圖3. 過(guò)表達(dá)和顯性負(fù)抑制對(duì)ANAC106在擬南芥花粉中的發(fā)育具有相反的影響
為鑒定ANAC106在調(diào)控絨氈層降解中的直接靶基因，通過(guò)DAP-seq鑒定出10665個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)，核心序列為“MRRYGSCGTNDHNDHNMCGBHRH"，該CGT(7n)MCG基序與已知NAC成員保守，且發(fā)現(xiàn)ANAC106結(jié)合GA3ox2啟動(dòng)子與GA3ox4第1外顯子。GO富集分析顯示赤霉素代謝基因富集。同時(shí)作者構(gòu)建了DEX誘導(dǎo)型株系，發(fā)現(xiàn)DEX處理致花發(fā)育缺陷及雄性不育。RNA-seqGO富集分析顯示，均富集赤霉素生物合成過(guò)程調(diào)控，且僅赤霉素處理上調(diào)ANAC106表達(dá)。EMSA、qPCR和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了ANAC106結(jié)合并激活GA3ox2/4表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)ANAC106還靶向GA2ox1。綜上表明，ANAC106可能通過(guò)靶向赤霉素合成與失活基因調(diào)控活性赤霉素平衡。
圖4. ANAC106直接調(diào)控?cái)M南芥赤霉烯（GA）代謝相關(guān)基因表達(dá)
為驗(yàn)證ANAC106對(duì)活性赤霉素（GA）水平的調(diào)控作用，作者通過(guò)UHPLC-MS/MS檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)基因株系，結(jié)果顯示經(jīng)DEX處理的OE株系活性GA含量顯著升高，EAR株系GA水平略低或與野生型持平，表明ANAC106雙向調(diào)控GA合成與失活。Westernblot結(jié)果顯示，OE株系中DELLA蛋白（RGA、GAI）豐度顯著降低，EAR株系中DELLA蛋白積累；DEX誘導(dǎo)ANAC106表達(dá)可促進(jìn)RGA/GAI降解，且蛋白酶體抑制劑MG132能抑制該過(guò)程，表明ANAC106通過(guò)GA依賴的泛素-蛋白酶體途徑降解DELLA。作者進(jìn)一步構(gòu)建MYC-GAI轉(zhuǎn)基因株系并與GVG:ANAC106雜交，發(fā)現(xiàn)DEX處理的雙轉(zhuǎn)基因株系MYC-GAI水平降約50%，且降解同樣依賴泛素-蛋白酶體途徑。此外，OE株系不育表型與rga/gai雙突變體相似，OE花序中RGA豐度降低、EAR株系中升高，進(jìn)一步表明DELLA蛋白參與ANAC106調(diào)控的花粉發(fā)育。
圖5. ANAC106正向調(diào)控?cái)M南芥中生物活性赤霉素（GAs）的水平，并負(fù)向影響DELLA蛋白的豐度
為進(jìn)一步探究ANAC106與DELLA蛋白的關(guān)系，作者構(gòu)建了兩個(gè)RGA-eYFP轉(zhuǎn)基因株系（分別由絨氈層特異性LTP12啟動(dòng)子和花粉特異性LAT52啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)），并與ANAC106-OE株系雜交獲得雙轉(zhuǎn)基因株系。結(jié)果顯示，兩種雙轉(zhuǎn)基因株系的不育表型均顯著恢復(fù)：可產(chǎn)生可育角果。亞歷山大染色顯示花粉活力大幅提升，半薄切片顯示絨氈層提前降解缺陷得到改善。以上結(jié)果表明，在ANAC106調(diào)控的花粉發(fā)育基因網(wǎng)絡(luò)中，DELLA蛋白在下游發(fā)揮重要作用。
圖6. ANAC106通過(guò)赤霉素（GA）-DELLA通路調(diào)控?cái)M南芥雄性生殖力
酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，擬南芥5種DELLA蛋白中，除RGL1外，其余4種均能與ANAC106相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，RGA和GAI在體內(nèi)可與ANAC106蛋白相互作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RGA和GAI均與ANAC106的N端區(qū)域（含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）相互作用，而不與C端相互作用。隨后，作者在擬南芥葉肉原生質(zhì)體中進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，ANAC106可激活GA3ox2、GA3ox4的熒光素酶活性，而RGA或GAI可劑量依賴地抑制該活性。綜上表明，DELLA蛋白與ANAC106的相互作用以劑量依賴方式抑制ANAC106的轉(zhuǎn)錄活性。
圖7. DELLA蛋白抑制ANAC106的轉(zhuǎn)錄活性
本研究揭示擬南芥中DELLA-ANAC106雙向負(fù)反饋回路調(diào)控赤霉素（GA）穩(wěn)態(tài)、維持雄性育性的機(jī)制：新發(fā)現(xiàn)的NAC轉(zhuǎn)錄因子ANAC106可激活GA合成基因（GA3ox2、GA3ox4）以提升活性GA水平，促進(jìn)DELLA蛋白降解；而DELLA蛋白（如RGA、GAI）則以劑量依賴方式與ANAC106互作，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，避免GA過(guò)量。ANAC106過(guò)表達(dá)（功能獲得）致絨氈層提前降解，顯性負(fù)抑制（功能缺失）致其延遲降解，二者均引發(fā)雄性不育。該回路通過(guò)自我校正實(shí)現(xiàn)花藥GA時(shí)空精準(zhǔn)調(diào)控，為植物生殖激素調(diào)控提供新范式。
圖8. DELLA-ANAC106反饋回路調(diào)控?cái)M南芥花粉發(fā)育的功能模型
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