客戶文章 ▏DAP-seq技術(shù)助力揭示水稻氮素吸收直接途徑和菌根途徑的新機(jī)制

2025年2月18日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)徐國華、陳愛群教授團(tuán)隊在PNAS期刊(IF=9.4)上發(fā)表了題為“OsNLP3 and OsPHR2 orchestrate direct and mycorrhizal pathways for nitrate uptake by regulating NAR2.1-NRT2s complexes in rice"的研究論文，該研究利用DAP-seq技術(shù)，系統(tǒng)的闡明了兩個轉(zhuǎn)錄因子OsNLP3和OsPHR2協(xié)同調(diào)控硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體NAR2.1-NRT2s介導(dǎo)的氮素吸收直接途徑和菌根途徑的分子機(jī)制。

研究背景

氮（N）是植物生長必需的營養(yǎng)元素，大多數(shù)陸地植物進(jìn)化出了兩種氮吸收途徑：一種是直接通過根系吸收的途徑，另一種是通過與叢枝菌根（AM）真菌共生的途徑。然而，這兩種途徑在硝酸鹽吸收過程中的相互作用尚不明確。

研究結(jié)果

采用分區(qū)培養(yǎng)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，水稻通過菌根吸收硝酸鹽的途徑比吸收銨更高效。葡糖醛酸酶（GUS）實驗顯示AM共生促進(jìn)硝酸鹽吸收和同化，上調(diào)相關(guān)還原酶基因表達(dá)，且在含叢枝細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)。

為了鑒定更多對水稻AM共生硝酸鹽吸收有重大貢獻(xiàn)的候選基因，作者通過qPCR分析，篩選出對硝酸鹽吸收具有關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)運(yùn)基因：OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3，以及編碼促進(jìn)NRT2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜的伴侶蛋白基因OsNAR2.1。葡糖醛酸酶（GUS）實驗顯示OsNAR2.1和OsNRT2s在菌根細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)，這些基因在共生硝酸鹽吸收中起重要作用。

隨后，通過在osnar2.1敲除株系和野生型（WT）植株中研究發(fā)現(xiàn)，OsNAR2.1功能喪失導(dǎo)致非菌根化和菌根化根中OsNRT2.1/2.2/2.3的表達(dá)降低，說明OsNAR2.1介導(dǎo)的運(yùn)輸系統(tǒng)對于收硝酸吸收的直接途徑和菌根途都是必需的。由于玉米ZmNAR2.1也顯示出 AM 誘導(dǎo)的表達(dá)模式，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)玉米ZmNAR2.1也參與共生硝酸鹽吸收，這表明該途徑在禾本科物種中保守。

NLPs 被認(rèn)為是硝酸鹽信號傳導(dǎo)中的主要轉(zhuǎn)錄因子，在陸地植物中廣泛保守，研究發(fā)現(xiàn)OsNLP3在調(diào)節(jié)硝酸鹽吸收直接和菌根途徑中起到關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步研究OsNLP3轉(zhuǎn)錄因子對硝酸鹽吸收和代謝的調(diào)控機(jī)制，作者進(jìn)行了酵母單雜交（Y1H）、電泳遷移率變動分析（EMSA）和染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP-qPCR分析，結(jié)果顯示OsNLP3能夠直接結(jié)合到OsNAR2.1啟動子的NRE-like1和NRE-like3基序上。熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示，OsNLP3激活OsNAR2.1啟動子。

OsNAR2.1、OsNRT2.1和OsNRT2.2的啟動子中至少有一個拷貝的PHR結(jié)合序列，因此推測，OsPHRs是否也可以調(diào)控硝酸鹽吸收。EMSA 、Y1H、熒光素酶報告實驗顯示，OsPHR1/2/3可以結(jié)合并激活OsNRT2.1、OsNRT2.1和OsNRT2.2的啟動子。osphr2突變體表現(xiàn)出降低的菌根共生效率和氮吸收能力，這說明OsPHR2正調(diào)控菌根硝酸鹽吸收途徑。

OsSPX4作為主要的細(xì)胞內(nèi)磷傳感器，能夠通過與OsPHR2和OsNLP3相互作用，整合磷和硝酸鹽信號通路。為了確定OsSPX4是否能夠干擾OsPHR2或OsNLP3對OsNAR2.1的激活，作者在煙草葉片中進(jìn)行了共轉(zhuǎn)化實驗，結(jié)果顯示OsSPX4 能夠顯著抑制OsPHR2或OsNLP3對LUC的激活。通過進(jìn)一步對OsSPX4功能的研究發(fā)現(xiàn)，OsSPX4可能通過與OsPHR2和OsNLP3的相互作用來調(diào)控菌根共生硝酸鹽和磷酸鹽吸收途徑。

為了更深入地了解OsNLP3調(diào)控菌根共生和共生硝酸鹽吸收的機(jī)制，作者進(jìn)行了DNA親和純化測序（DAP-seq），共鑒定出超過84,000個潛在的OsNLP3靶標(biāo)區(qū)域，大約21%的結(jié)合位點位于啟動子區(qū)域。Motif富集分析發(fā)現(xiàn)，TGA(C)CCCT(C) 是OsNLP3結(jié)合位點顯著富集的基序。鑒于OsPHR2和OsNLP3共同調(diào)控共生硝酸鹽吸收，對OsNLP3和OsPHR2的潛在靶基因與在AM共生根中的差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行了重疊分析。發(fā)現(xiàn)，在AM共生根中上調(diào)的1,122個基因同時也是OsNLP3和OsPHR2的共同靶基因。這些靶基因包括多個參與氮吸收和代謝的關(guān)鍵基因，例如NAR2.1、NRT2s、NPF4.5和NiR1。此外，一些在AM啟動和叢枝發(fā)育中起關(guān)鍵作用的基因也被鑒定為靶基因，例如SL生物合成基因D10和D17、脂質(zhì)生物合成基因RAM2，FatM和DMI3。

通過在水稻原生質(zhì)體中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活實驗，發(fā)現(xiàn)D17、NiR1、DMI3和OsRLI1的啟動子可以被OsNLP3和OsPHR2分別激活，從而證實了DAP-seq的結(jié)果。此外，除了RLI1在osnlp3菌根共生根中的表達(dá)水平與野生型菌根共生根相比沒有顯著變化外，其他選定基因在osnlp3和osphr2突變體的菌根共生根中表現(xiàn)出顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，OsPHR2和OsNLP3共同調(diào)控共生硝酸鹽吸收和AM共生途徑。

研究結(jié)論

該研究闡明了協(xié)調(diào)氮素吸收的直接途徑和菌根途徑的作用機(jī)制，完善了菌根氮素營養(yǎng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步利用菌根途徑提高作物氮素利用效率提供了理論基礎(chǔ)和重要基因資源。