N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中RNA最常見的內(nèi)部修飾，在多種生物過程，如RNA穩(wěn)定性、剪接、轉(zhuǎn)運和翻譯中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。但檢測所需大量的RNA阻礙了哺乳動物早期胚胎中的m6A分析。本研究通過應(yīng)用低起始量的甲基RNA免疫沉淀和測序技術(shù)（picoMeRIP-seq），成功繪制了小鼠卵母細胞和著床前胚胎中N6-甲基腺苷（m6A）修飾的動態(tài)圖譜，揭示了m6A修飾在調(diào)控早期胚胎發(fā)育、基因表達、母體到合子轉(zhuǎn)換過程中的關(guān)鍵作用，以及m6A通過在逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子衍生的RNA上的富集來維持基因組穩(wěn)定性和細胞特性。為深入理解m6A修飾在哺乳動物早期發(fā)育中的調(diào)控機制提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源和科學(xué)見解。
1.小鼠卵母細胞和早期胚胎中m6A的全局視圖
為了評估m6A修飾的全局水平，作者對處于卵母細胞期（GV）和中期II（MII）階段的卵母細胞，以及處于合子、兩細胞、四細胞、桑椹胚和囊胚階段的早期胚胎進行了m6A的免疫熒光染色，在所有階段都檢測到了m6A的存在。同時利用picoMeRIP-seq技術(shù)，在GV、MII、合子、兩細胞、八細胞和囊胚六個階段（每個階段2個生物學(xué)重復(fù)）生成了全轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A圖譜。平均每個階段識別出11965個m6A峰值，每個階段攜帶m6A修飾的基因數(shù)量分別為5,776（GV）、5,076（MII）、4,579（合子）、4,851（兩細胞）、5,905（八細胞）和6,234（囊胚）。這些m6A峰值在終止密碼子附近顯著富集，并且在所有階段顯示出清晰的RRACH（R=G/A，H=A/C/U）共識基序。進一步通過全轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性分析和主成分分析（PCA），結(jié)果顯示六個階段一致性均非常高，同時呈現(xiàn)明顯的聚類。這些結(jié)果為理解m6A在早期胚胎發(fā)育中的調(diào)控作用提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
圖1.小鼠卵母細胞和胚胎的RNA m6A圖譜
2.母體到合子轉(zhuǎn)換期間的m6A動態(tài)變化
母體到合子轉(zhuǎn)換期間是哺乳動物胚胎發(fā)育早期的一個關(guān)鍵階段，此時胚胎從依賴母體提供的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾囎陨砘虮磉_，在小鼠中該過程發(fā)生在受精后的兩細胞階段。為評估該轉(zhuǎn)換期間的m6A動態(tài)變化，作者首先定義2個概念，分別是m6A+和m6A-（一個基因如果其任何轉(zhuǎn)錄本在給定階段的≥1個生物學(xué)重復(fù)中與m6A峰值重疊，則為m6A+，否則為m6A-），在6個階段中共有1,579個基因被鑒定為m6A+，同時GO分析表明m6A+和m6A-在功能上有明顯區(qū)別。進一步對6個階段的m6A狀態(tài)進行分析，發(fā)現(xiàn)在合子和兩細胞階段之間觀察到m6A狀態(tài)的顯著變化，與合子相比兩細胞階段有2,356個基因獲得了m6A，2,084個基因失去了m6A。其中，66%的m6A獲得和62%的m6A丟失基因可以通過基因表達重編程來解釋，同時母體RNA降解和合子基因組激活（ZGA）在這一時期同步發(fā)生。
接下來，作者通過香農(nóng)熵的方法評估了特定階段表達基因的m6A圖譜。共識別了5,996個特定階段表達的基因（分為8組），m6A+的分布范圍在40%~70%不等。整體來看轉(zhuǎn)錄因子與其它表達基因相比顯示出顯著的m6A富集，并主要集中在與早期胚胎多能性維持和與功能分化有關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子上。其中85%特定階段表達的轉(zhuǎn)錄因子的mRNA被m6A標記，89%的轉(zhuǎn)錄因子在至少一個發(fā)育階段存在m6A修飾。表明m6A+基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)強烈相關(guān)，以上分析結(jié)果為未來研究探索m6A在早期胚胎發(fā)育中的潛在作用提供了基礎(chǔ)。
圖2.在發(fā)育過程中m6A甲基化動態(tài)的特征分析
3.衰變基因和 ZGA 基因的 m6A 標記和 miRNA 靶向
為了評估m6A修飾在母源性RNA降解及合子基因激活過程中的作用。作者首先識別到2293個母源性降解基因（Decay）與726個合子基因（ZGA）。并根據(jù)受精前后不同的降解模式將Decay分為3個亞群，分別是M-Decay、Z-Decay、C-Decay。其中M-decay基因中m6A+基因的比例小于30%，Z-decay和C-decay基因在卵母細胞中的m6A+基因比例均超過了50%，而在兩細胞階段的ZGA基因m6A+基因比例為46%。進一步通過GO分析，證明m6A+降解基因主要與凋亡、細胞形態(tài)調(diào)節(jié)、生殖細胞發(fā)育相關(guān)，而m6A+ ZGA基因在胚胎發(fā)生的一系列過程中均顯著富集，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞增殖和胚胎著床。
之前研究結(jié)果已證實mESCs中的miRNA傾向于靶向m6A修飾的區(qū)域。作者想進一步探究miRNA是否靶向m6A+降解基因和ZGA基因，通過與miRNA表達數(shù)據(jù)比較得出，降解基因和ZGA基因中miRNA更傾向于靶向m6A+基因，且降解組中miRNA靶向的m6A+基因比例顯著高于ZGA組。同時發(fā)現(xiàn)miRNA靶向的m6A+基因在降解組和ZGA組中似乎介導(dǎo)相反的功能。以上結(jié)果揭示了m6A修飾在小鼠發(fā)育中的重要作用，特別是母體RNA降解、合子基因激活以及與miRNAs相互作用方面。
圖3.在發(fā)育過程中m6A標記和miRNA靶向譜在Decay和ZGA基因上的特征分析
4.m6A沉積于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子衍生的RNA上
逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是指一類可以通過逆轉(zhuǎn)錄過程在基因組中移動的DNA片段，主要分為LTR、LINE、SINE三種。先前已有研究表明m6A通過調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子衍生的RNA分子的穩(wěn)定性和表達，從而影響干細胞的功能和狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)超過50%的m6A峰值與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點重合，且逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點主要來自ERVL-MaLR、ERVL和L1/LINE-1家族的五個亞家族，包括MTA、ORR1A0、ORR1A1、MERVL和L1Md_T。5個位點在富集時期與程度、分布模式以及富集區(qū)域基序上均存在差異。從富集時期與程度程度來看，MTA在卵母細胞和合子中m6A富集較強，MERVL在兩細胞胚胎中m6A富集較豐富；從分布模式來看MTA序列上的m6A分布相對均勻，而MERVL、L1Md_T、ORR1A0和ORR1A1上的m6A占據(jù)位置有明顯偏好；從富集區(qū)域基序來看GGACU基序在MTA、MERVL、ORR1A0和ORR1A1的m6A富集區(qū)域中頻繁出現(xiàn)，而RRACU基序在所有五個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子亞家族的整個序列中都很豐富。以上研究結(jié)果證實了m6A修飾在調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子活性在維持基因組穩(wěn)定性和細胞特性發(fā)揮重要作用。
圖4.m6A在逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的RNA上的沉積
結(jié)論
該研究通過使用低輸入甲基RNA免疫沉淀和測序技術(shù)，克服了在哺乳動物早期胚胎中進行m6A分析的難題。研究發(fā)現(xiàn)，在從母體到合子轉(zhuǎn)變的過程中，m6A廣泛存在于母體遺傳的轉(zhuǎn)錄本和合子激活的基因中，并且這些m6A標記的母體遺傳轉(zhuǎn)錄本更可能被miRNAs靶向，而特定的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RNA，如MTA和MERVL，也被發(fā)現(xiàn)富含m6A修飾。這些發(fā)現(xiàn)不僅補充哺乳動物卵母細胞和早期胚胎的轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m6A圖譜的空白，同時為未來研究m6A在哺乳動物早期胚胎發(fā)育中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。
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