介紹酵母單雜交的基本操作過程

　　酵母單雜交(Yeastone-hybrid)是根據(jù)DNA結合蛋白(即轉錄因子)與DNA順式作用元件結合調控報道基因表達的原理，克隆與靶元件特異結合的轉錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論基礎是：許多真核生物的轉錄激活子由物理和功能上獨立的DNA結合區(qū)(DNA-bindingdomainBD)和轉錄激活區(qū)(ActivationdomainAD)組成，因此可構建各種基因與AD的融合表達載體，在酵母中表達為融合蛋白時，根據(jù)報道基因的表達情況，便能篩選出與靶元件有特異結合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結合區(qū)域的蛋白。

　　酵母單雜交的基本操作過程：

　　(1)設計含目的基因(稱為誘餌)和下游報告基因的質粒，并將其轉入酵母細胞。

　　(2)將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉錄激活域融合表達的cDNA文庫質粒轉化人同一酵母中。

　　(3)若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報告基因的表達將文庫蛋白的編碼基因篩選出來。在這里作為誘餌的目的基因就是啟動子DNA片段，文庫基因所編碼的蛋白就是啟動子基因結合蛋白。

　　迄今為止，應用酵母單雜交體系已經識別并驗證了許多與目的DNA序列結合的蛋白質，同時單雜交技術還被應用于識別金屬反應結合因子。正向與反向單雜交體系的結合，還可用于篩選阻礙DNA與蛋白質相互作用的突變的單個核苷酸。

　　目前，在研究DNA—蛋白質相互作用中，酵母單雜交體系主要有以下3種用途：①確定已知DNA—蛋白質之間是否存在相互作用;②分離結合于目的順式調控元件或其他短DNA結合位點蛋白的新基因;③定位已經證實的具有相互作用的DNA結合蛋白的DNA結合結構域，以及準確定位與DNA結合的核苷酸序列。